Структура бактериальной стерол-редуктазы поможет разобраться с нарушениями биосинтеза стеролов у человека

Метод обнаружения растительных стеринов

Продукты животного и растительного происхождения имеют четкие различия по составу стеринов.

Стерины делятся на группы:

• зоостерины (содержатся только в животных жирах)
• фитостерины (содержатся только в растительных)
• микостерины (содержатся только в грибах)

Самый распространенный из зоостеринов – холестерин, которым представлена основная часть всех стеринов молочного и других видов животных жиров. Наиболее известные фитостерины – β-ситостерин, брассикастерин, кампестерин и стигмастерин: ими представлена основная часть всех стеринов жиров растительного происхождения. Другими словами, в стериновой фракции молочного жира содержится лишь холестерин и не могут содержаться фитостерины, и, наоборот, в растительном жире присутствуют исключительно фитостерины, холестерина же в нем нет.

Присутствие на хроматограмме пика β-ситостерина говорит о наличии в продукте растительных жиров.

При обнаружении растительных стеринов руководствуются ГОСТ 33490-2015 и ГОСТ 31979-2012. Чтобы выделить стерины из продуктов, применяется щелочной гидролиз предварительно выделенной жировой фракции продукта с последующим экстрагированием неомыляемой стериновой фракции. Фальсификация выявляется при анализе состава стериновой фракции методом газовой хроматографии. Присутствие на хроматограмме пика β-ситостерина говорит о наличии в продукте растительных жиров. Остальные фитостерины дополнительно подтверждают факт фальсификации.

Как видно на хроматограмме (1а), молочный жир имеет один пик холестерина. На хроматограмме стеринов подсолнечного масла (1б) пиков три и они соответствуют фитостеринам – кампестерину, стигамастерину и β-ситостерину. На хроматограмме молочного жира с растительными добавками (1в) одновременно визуализируются и пик холестерина, и пики фитостеринов – брассикастерина, кампестерина, стигмастерина и β-ситостерина.

Согласно лабораторным исследованиям с контрольными образцами, метод обнаружения растительных стеринов позволяет выявить фальсификацию при содержании фитостеринов 2%.

Специфические полистерины

• Молекула, показанная в верху страницы, — β-ситостерин[en].
• С удалённым атомом углерода 242 получается кампестерин.
• C удалением атомов углерода 241 и 242, будет получен холестерин.
• После удаления атомов водорода у атомов углерода 22 и 23 будет получен стигмастерин (stigmasta-5,22-dien-3β-ol).
• Удаление углерода 242 и водородов у атомов 22 и 23 приводит к брассикастерину (ergosta-5,22-dien-3β-ol).
• Дальнейшее удаление атомов водорода у атомов углерода 7 и 8 у уже полученной молекулы брассикастерина приводит к появлению эргостерина (ergosta-5,7,22-trien-3β-ol).

Определение состава стеринов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Издание официальное

Мики

СтждцтмИЯ*

яи

ГОСТ 34456—2018

Функции фитостеринов

Растения содержат ряд фитостеринов. Они работают структурными компонентами клеточной мембраны. В клетках млекопитающих ту же роль выполняет холестерин.

Получение и применение эргостерина

Природные источники генов резистентности бактерий к антибиотикам. Организационные мероприятия как путь ограничения распространения генов антибиотикорезистентности.

См презентацию

Эргостерин. Источники получения. Требования к среде для биосинтеза эргостерина.

Эргостерин – исходный продукт производства жирорастворимого витамина D2 и кормовых препаратов, обогащенных витамином D2. В группу витаминов Dобъединяют родственные соединения, важнейшими из которых являются витамины D2 и D3, обладающие антирахитичным действием.

Витамин D2 (эргокальциферол) образуется при облучении ультрафиолетовым излучением эргостерина, витамин D3 (холекальциферол) образуется из 7-дегидрохолестерина. В организме человека и животных эти соединения регулируют усвоение кальция и фосфора из пищи и отложение их в костной ткани.

В основе структуры эргостерина и витамина D лежит четыре углеродных цикла (А, В, С, D). В случае витамина D кольцо В разомкнуто.

Продуценты эргостерина

Источником эргостерина являются фитопланктон, бурые и зеленые водоросли, но особенно богаты эргостерином дрожжи и плесневые грибы, которые и служат сырьем для его промышленного получения [1,4,5].

В отношении эргостерол синтезирующей способности (% эргостерола в абсолютно сухих дрожжах) дрожжи при поверхностном культивировании располагаются в следующем порядке: Saccharomyces. carlsbergensis (0,49-4,3), S. ellipsoidetis (1,2-1,5), Rhodotorula glutinis (0,7-0,9), Candidautilis (0,4-0,6), С. tropicalis ( 0,2-0,3).

В мицелии грибов Aspergillus и Penicillium содержание стеринов может достигать 1,2-1,4%; (Р. westlingii около 2,2%) в расчете на сухой мицелий [1,5]. Бактерии, как правило, синтезируют ничтожные количества стеринов. Обычно содержание стеринов в их клетках составляет 0,001-0,1 мг/г сухой биомассы.

Стерины обнаружены у Lactobacillus arabinosus, L. pentosus, Escherichia coli, Azotobacter chroococcum, Micromonosporasp., Streptomyces griseus, Sphaerotillis natans, Rhodospirillum rubrum.

Биосинтез эргостерина

Стерины относятся к терпенам и имеют путь биосинтеза, подчиняющийся «изопреновому правилу».

В соответствии с этим правилом, стерины (тритерпены) синтезируются из изопреновых единиц в результате прохождения четырех стадий: 1) образование мевалоната из ацетил-КоА или лейцина; 2) дегидратирование и декарбоксилирование мевалонилпирофосфата с образованием «активного изопрена» – изопентенилпирофосфата и конденсация изопреновых звеньев с образованием ациклических терпенов разной длины; 3) циклизация ациклических структур; 4) дальнейшая модификация циклической структуры. Интермедиатами синтеза стеринов являются ацетат, мевалоновая кислота, сквален, ланостерин. Сквален – общий предшественник стеринов растительного и животного происхождения, накапливается в дрожжах и при аэрации превращается в стерин. Расхождение путей происходит на уровнефарнезилпирофосфата:

В случае стеринов он димеризуется с образованием сквалена.

При циклизации и отщеплении протона образуется ланостерин, предшественник холестерина и эргостерина:

Условия образования эргостерина дрожжами. Наиболее высокие количества стеринов синтезируют штаммы Saccharomyces carlsbergensis ИНМИ-101 и Sacch. carlsbergensis. Биомасса Sacch. carlsbergensis может содержать более 10% эргостерина. Важное условие синтеза эргостерина дрожжами – хорошая аэрация.

В анаэробных условиях в клетках дрожжей накапливается предшественник эргостерина – сквален. Показано, что кислород индуцирует синтез стеринов, оказывая активирующее влияние на эпоксидазу сквалена – первого фермента биосинтетического пути.

Индукция синтеза эргостерина начинается при 0,03%-ом содержании О2 в газовой фазе и достигает максимума при 2%-ой концентрации.

Для биосинтеза стеринов дрожжами важно, чтобы среда содержала большой избыток углеводов и мало азота. Дрожжи, богатые белком, как правило, содержат мало стеринов. Эти данные касаются главным образом пекарских дрожжей. В случае дрожжей рода Candidaвысокое C/Nв среде приводит к накоплению липидов, а не эргостерина.

Для дрожжей, использующих н-алканы, последние являются лучшим источником углерода для синтеза эргостерина, чем углеводы.

Стимулирующее действие на образование стеринов дрожжами оказывают ингибиторы гликолиза и разобщители окислительного фосфорилирования и дыхания, а также обеспеченность дрожжей витаминами, и прежде всего пантотеновой кислотой, которая в составе КоА участвует в построении молекулы эргостерина.

При действии на дрожжи рентгеновского излучения содержание эргостерина увеличивается в 2-3 раза, что объясняют угнетением процесса аминирования, сопровождающегося повышением синтеза липидов. Синтез стеринов не связан с ростом дрожжей. стеринов повышается по мере старения культуры и стеринообразование продолжается после остановки роста дрожжей.

Получение и применение эргостерина

В промышленности эргостерин получают, используя дрожжи Sacch. cerevisiae, Sacch. carlsbergensis, атакже мицелиальные грибы [1,5]. Засев производят большим количеством инокулята. Культивирование ведут при высокой температуре и сильной аэрации в среде, содержащей большой избыток источников углерода по отношению к источникам азота.

На выход витамина D2 (и образование других соединений) оказывают влияние длительность облучения, температура, наличие примесей. Поэтому облучение эргостерина, используемого в качестве пищевых добавок, производят с большой осторожностью.

Для получения кристаллического витамина D2дрожжи или мицелий грибов подвергают гидролизу раствором соляной кислоты при 110°С. Гидролизованную массу обрабатывают спиртом при 75-78°С и после охлаждения до 10-15°С фильтруют. Фильтрат упаривают до содержания в нем 50% сухих веществ и используют как концентрат витаминов группы В.

Витамин D2получают из массы, оставшейся после фильтрации. Массу промывают, сушат, размельчают и дважды обрабатывают при 78°С трехкратным объемом спирта. Спиртовые экстракты сгущают до 70%-ого содержания сухих веществ. Таким образом получают липидный концентрат. Его омыляют раствором NaOH, а стерины остаются в неомыленной фракции.

Кристаллы эргостерина выпадают из раствора при 0°С. Очистку кристаллов проводят путем перекристаллизации, последовательным промыванием 69%-ым спиртом, смесью спирта и бензола (80:20) и повторной перекристаллизацией. Полученные кристаллы эргостерина сушат, растворяют в эфире, облучают, после чего эфир отгоняют, а раствор витамина концентрируют и кристаллизуют.

Для получения масляного концентрата раствор витамина после фильтрации разбавляют маслом до стандартного уровня [1]. Обогащенные эргостерином, облученные ультрафиолетовым излучением дрожжи используют в животноводстве как кормовую добавку. Эргостерин – исходный продукт для получения некоторых стероидных гормонов, лечебных и пищевых препаратов.

Количество производимого пока эргостерина недостаточно для нужд народного хозяйства и внедрение новых производственных мощностей – задача ближайшего будущего.

Правила оказания Услуги «Подписка на доступ к сайту www.letitbit.net»

Дата добавления: 2018-04-04; просмотров: 932;

Источник: https://studopedia.net/3_1594_poluchenie-i-primenenie-ergosterina.html

Функции

Главной функцией витамина D является обеспечение всасывания кальция из продуктов питания в тонком кишечнике (преимущественно в двенадцатиперстной кишке). Также ряд клинических исследований заставляет предполагать следующие дополнительные функции витамина D: участие в регуляции размножения клеток, обменных процессов, стимуляция синтеза ряда гормонов.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 12.1.004—91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие тре

бования

ГОСТ 12.1.005—88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007—76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.019—79 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты*

ГОСТ 12.4.009—83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание

ГОСТ 12.4.021—75 Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требования

ГОСТ OIML R 76-1—2011 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ ISO 707—2013 Молоко и молочные продукты. Руководство по отбору проб»

ГОСТ 1770—74 (ИСО 1042—83. ИСО 4788—80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилин

дры. мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ ИСО 5725-1—2003 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов из

мерений. Часть 1. Основные положения и определения ***

ГОСТ 6709—72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 13928—84 Молоко и сливки заготовляемые. Правила приемки, методы отбора проб и подготовка их к анализу

ГОСТ 24363—80 Реактивы. Калия гидроокись. Технические условия

* В Российской Федерации действует ГОСТ Р 12.1.019—2009 «Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты».

“ В Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 707—2010 «Молоко и молочные продукты. Руководство по отбору проб».

В Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 5725-1—2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения».

Издание официальное

ГОСТ 34456—2018

ГОСТ 25336—82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26809.1—2014 Молоко и молочная продукция. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу. Часть 1. Молоко, молочные, молочные составные и молокосодержащие продукты

ГОСТ 26809.2—2014 Молоко и молочная продукция. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу. Часть 2. Масло из коровьего молока, спреды, сыры и сырные продукты, плавленые сыры и плавленые сырные продукты

ГОСТ 27752—88 Часы электронно-механические кварцевые настольные, настенные и часы-будильники. Общие технические условия

ГОСТ 28498—90 Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний

ГОСТ 29227—91 (ИСО 835*1—81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты» за текущий год. Если ссылочньм стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

Критика

Несмотря на существующие свидетельства о том, что растительные фитостерины способны уменьшать уровень холестерина у людей, ряд исследований показал, что влияние фитостеринов на человеческий организм неоднозначно, и они могут увеличивать вероятность сердечно-сосудистых заболеваний и смерти.[7][8][9]

Другие использования

Эргостерин используется также как индикатор грибной биомассы в почве. Хотя он все-таки разлагается со временем, но при низких температурах и в темноте, это расписание можно замедлить или полностью остановить. Опыт показал, что эргостерина может иметь противораковые свойства.

Модель одна — прозрений много

На основании модели фермента MaSR1 построены гомологичные модели для стерол-редуктаз человека LBR и DHCR7. Модели использовали для картирования известных мутаций. Практически все мутации, приводящие к развитию скелетной дисплазии Гринберга, аномалии лейкоцитов Пельгера и синдрому Смита-Лемли-Опица, приходятся на каталитический домен и домены, обеспечивающие связывание с кофактором и субстратом. Сходство патогенеза указанных заболеваний обусловлено сходными нарушениями в процессе восстановления стеролов. Примечательно, что стерол-редуктазы узнают свой невосстановленный субстрат достаточно неспецифично. Так, MaSR1 может восстанавливать двойные связи и C27Δ, и эргоста-8,14-диенола (субстрат стерол-редуктазы дрожжей). Столь же неспецифична и LBR: может катализировать восстановление C27Δ, компенсировать функцию C14SR, а также катализировать восстановление различных стерольных субстратов дрожжей.

И, наконец, структура MaSR1 проливает свет на функцию LBR. Поиск полных структурных гомологов MaSR1 среди известных структурных белков не увенчался успехом, однако обнаружилось сходство между трансмембранными доменами TM6–10 MaSR1 и изопренилцистеин-метилтрансферазой (ICMT). ICMT распознает, а затем карбоксиметилирует фарнезилированный цитозин субстрата. Возможно, C14SR-домен LBR занимается примерно тем же самым: распознает фарнезилированный цитозин преламина А или ламина B и тем самым регулирует их транспорт в ядро.

1. Липидный фундамент жизни;
2. Холестериновая страшилка, которая правит миром;
3. Li X., Roberti R., Blobel G. (2015). Structure of an integral membrane sterol reductase from Methylomicrobium alcaliphilum. Nature 517, 104–107;;
4. Chen C.P., Rost B. (2002). State-of-the-art in membrane protein prediction. Appl. Bioinf. 1, 21–35;;
5. Торжество компьютерных методов: предсказание строения белков;
6. В генетическом контакте.

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применены термины с соответствующими определениями:

3.1 етерины (стеролы): высокомолекулярные полициклические природные спирты, относящиеся к группе стероидов, в основе структуры которых лежит насыщенный тетрациклический углеводород стеран.

3.2 фитостерины (фитостеролы, растительные стериныУстеролы): Высокомолекулярные полициклические природные спирты, относящиеся к группе стероидов, в основе структуры которых лежит насыщенный тетрациклический углеводород стеран. естественным образом присутствующие только в растениях (Р-ситостерин. брассикастерин. кампестерин. стигмастерин).

3.3 абсолютное время удерживания: Отрезок времени, проходящий с момента ввода вещества в колонку хроматографа до появления максимума пика вещества на хроматограмме.

Библиография

Формы

Источник: http://ru.wikipedia.org/

Токсичность

При глотании большого количества эргостерина может возникать гиперкальциемия, которая, при длительной действия, может привести к отложению солей кальция в мягких тканях, особенно в почках.

7 Подготовка к проведению измерений

7.1 Приготовление растворов

7.1.1 Приготовление раствора калия гидроокиси в метаноле молярной концентрации

2,0 моль/дм3

В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают (11.200 ± 0,001) г калия гидроокиси, добавляют небольшое количество метанола и аккуратно перемешивают. Объем раствора доводят метанолом до метки.

Срок хранения раствора при комнатной температуре — не более 1 мес.

7.1.2 Приготовление раствора холестерина в метаноле

В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают (0,005 ± 0.001) г холестерина, добавляют небольшое количество метанола и аккуратно перемешивают. Объем раствора доводят метанолом до метки.

Срок хранения раствора при комнатной температуре — не более 1 мес.

7.1.3 Приготовление раствора р-ситостерина

8 мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают (0.005 ± 0.001) г Р-ситостерина. добавляют небольшое количество метанола и аккуратно перемешивают. Объем раствора доводят метанолом до метки.

Срок хранения раствора при комнатной температуре — не более 1 мес.

ГОСТ 34456—2018

7.1.4 Приготовление раствора брассикаетерина

В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают (0.005 ± 0.001) г брассикаетерина, добавляют небольшое количество метанола и аккуратно перемешивают. Объем раствора доводят метанолом до метки.

Срок хранения раствора при комнатной температуре — не более 1 мес.

7.1.5 Приготовление раствора кампестерина

В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают (0,005 ± 0.001) г кампестерина. добавляют небольшое количество метанола и аккуратно перемешивают. Объем раствора доводят метанолом до метки.

Срок хранения раствора при комнатной температуре — не более 1 мес.

7.1.6 Приготовление раствора стигмастерина

В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают (0,005 ± 0.001) г стигмастерина. добавляют небольшое количество метанола и аккуратно перемешивают. Объем раствора доводят метанолом до метки.

Срок хранения раствора при комнатной температуре — не более 1 мес.

7.1.7 Приготовление рабочего раствора смеси стеринов

В мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают по 1 см3 растворов стеринов по 7.1.2 — 7.1.6. добавляют небольшое количество метанола и аккуратно перемешивают. Объем раствора доводят метанолом до метки.

Срок хранения смеси стеринов при температуре (4 ± 2) вС — не более 1 мес.

7.2 Подготовка хроматографа

Подготовку хроматографа к работе проводят в соответствии с прилагаемой к хроматографу инструкцией.

Условия хроматографирования.

Изократическое элюирование смесью подвижной фазы ацетонитрил/еода (95/5) (V7V) при скорости потока 1 см3/мин. температура колонки 30 °C. Объем вводимой пробы 0.020 см3. Детектирование осуществляется при помощи спектрофотометрического детектора при длине волны 205 нм.

7.3 Подготовка пробы исследуемого продукта

Выделение стеринов из испытуемого продукта проводят методом омыления с последующей экстракцией.

7.3.1 Подготовка пробы молока и молочной продукции с массовой долей жира менее 40 %

7.3.1.1 В круглодонную колбу вместимостью 250 см3 помещают (20.000 ±0,001) г пробы продукта и добавляют 100 см3 раствора гидроокиси калия в метаноле молярной концентрации 2.0 моль/дм3.

7.3.1.2 К колбе подсоединяют обратный холодильник, кипятят на водяной баке в течение 30 мин и охлаждают.

7.3.1.3 Первое экстрагирование. После охлаждения раствор переливают в делительную воронку (№ 1) вместимостью 250 см3, добавляют 50,0 см3 смеси гексана и диэтилового эфира 1:1 (V/V). Раствор перемешивают, интенсивно встряхивая. После разделения смеси нижний слой сливают в стакан вместимостью 150 см3. Верхний спой помещают в чистую делительную воронку (Ns 2) вместимостью 250 см3.

7.3.1.4 Второе экстрагирование. Отобранный по 7.3.1.3 нижний слой помещают в делительную воронку (Ns 1). добавляют к нему 50 см3 смеси гексана и диэтилового эфира 1:1 (V/V). Раствор перемешивают. интенсивно встряхивая. После разделения смеси нижний слой сливают в стакан вместимостью 150 см3. Верхний слой помещают в делительную воронку (Ns 2) с ранее отделенным верхним слоем, полученным после 1-го экстрагирования.

7.3.1.5 Третье экстрагирование. Отделившийся после 2-го экстрагирования нижний слой помещают в делительную воронку (Ns 1). добавляют к нему 50 см3 смеси гексана и диэтилового эфира 1:1

(V/V). Раствор перемешивают, интенсивно встряхивая. После разделения смеси нижний слой выливают (утилизируют), верхний слой помещают в делительную воронку (№ 2) с раствором, полученным после 1-го и 2-го экстрагирований.

7.3.1.6 Полученный раствор промывают дистиллированной водой порциями по 50 см3, сливая нижний слой, до нейтральной реакции, определяемой с помощью лакмусовой бумаги.

Промытый экстракт переливают в круглодонную колбу вместимостью 250 см3. Колбу подсоединяют к ротационному испарителю и упаривают экстракт досуха.

К полученному остатку добавляют 1 см3 метанола и аккуратно перемешивают. Полученный раствор используют для измерений.

7.3.2 Подготовка пробы молочной продукции с массовой долей жира более 40 %

7.3.2.1 В круглодонную колбу вместимостью 250 см3 помещают (5.000 ± 0,001) г пробы продукта и добавляют 50 см3 гидроокиси калия молярной концентрации 2,0 моль/дм3.

7.3.2.2 Далее проводят процедуры по 7.3.1.2— 7.3.1.6.

13 Требования к оператору

Выполнение измерений может проводить специалист, имеющий специальное образование и освоивший метод в соответствии с требованиями настоящего стандарта.

УДК 637.147.2:543.06:006.354

МКС 67.100.01

Ключевые слова: молоко, продукция молочная, стерины, метод высокоэффективной жидкостной хроматографии. холестерин, фитостерины. 6-ситостерин. брассихастерин, кампестерин. стигмастврин, термины и определения, сущность метода, отбор проб, подготовка к проведению измерений, проведение измерений, обработка результатов измерений, требования безопасности

БЗ 10—2018/11

Редактор Л.В. Корвтникова Технический редактор В.Н. Прусакова Корректор М.И. Першина Компьютерная верстка АН. Золотаревой

Сдано о набор 06.09.2016. Подписано в печать 13.09.2018. Формат 60*84’/в. Гарнитура Ариал Усл. печ. л. 1.40. Уч.-иэд. л. 1.24.

Подготовлено на основе электронном версии, предоставленной разработчиком стандарта

Создано в единичном исполнении , 117418 Москва. Нахимовский лр-т. д. 31, к. 2. www.goslinto.ru mtoQgosbnto.ru